Streszczenie

sekwencjonowanie całego genomu bakterii dostarczyło obfitości sekwencji profagów jako produktu ubocznego, a analiza tych sekwencji ujawniła sposoby, w jakie fagi wpłynęły na Genom ich bakterii gospodarza w różnych gatunkach bakterii. Celem pracy była identyfikacja sekwencji związanych z fagami w projekcie zespołu genomu Avibacterium paragallinarum, czynnika sprawczego coryzy zakaźnej u drobiu. Montaż całego genomu nie był możliwy ze względu na obecność luk i (lub) powtórzeń istniejących na końcach stygów. Jednak adnotacja genomu ujawniła sekwencje prophage i prophage remnant obecne w tym genomie. Na podstawie uzyskanych wyników można było zidentyfikować kompletny bakteriofag podobny do Mu, który został określony jako AvpmuC-2M. zidentyfikowano również kompletną sekwencję bakteriofagów podobnych do HP2, nazwaną AvpC-2M-HP2.

1. Wprowadzenie

bakteriofagi zostały po raz pierwszy odkryte w Anglii w 1915 roku przez Fryderyka W. Twort i niezależnie od niego w 1917 roku przez Felixa D 'Herelle’ a w Instytucie Pasteura w Paryżu . Bakteriofagi to wirusy, które infekują bakterie i można je podzielić na dwie grupy w zależności od ich sposobu interakcji z komórką bakteryjną, a mianowicie fagi lityczne (wirulentne) i umiarkowane (lizogeniczne). Fagi lityczne postępują zazwyczaj z replikacją w momencie infekcji komórki gospodarza, gdzie duża liczba nowych wirusów jest uwalniana przez lizę komórki gospodarza. Umiarkowane fagi niekoniecznie rozpoczynają replikację natychmiast po zakażeniu i w zależności od wielu warunków, fagi te mogą integrować swój chromosom z genomem komórki gospodarza, zachowując w ten sposób milczenie aż do indukcji . Gdy Genom bakteriofagowy jest zintegrowany z genomem komórki gospodarza, jest on określany jako profage. Proroctwa są głównymi podejrzanymi w przypadku adaptacji istniejących patogenów do nowych gospodarzy lub pojawienia się nowych patogenów lub klonów epidemii . Bakterie nie mają cyklu życia seksualnego, a wymiana alleli w obrębie populacji odbywa się poprzez poziomy transfer genów, a źródłem tego DNA mogą być m.in. fagi . O ile nie jest to ograniczone przez barierę gatunkową, całe jednostki funkcjonalne mogą być importowane z tych źródeł, a przenoszone DNA może mieć rozmiar od 1 kb do ponad 100 kb i może kodować złożone struktury powierzchniowe lub nawet całe szlaki metaboliczne . Od dawna wiadomo, że bakteriofagi przyczyniają się do patogenności ich gospodarzy bakteryjnych, ponieważ wykazano, że wiele genów przechodzi transfer między bakteriami przez fagi . Geny te mogą kodować zróżnicowany podzbiór czynników zjadliwości, takich jak toksyny, czynniki regulacyjne (które regulują ekspresję genów zjadliwości gospodarza) i enzymy, które mogą zmieniać składniki zjadliwości bakterii .

bakteryjne sekwencjonowanie całego genomu dostarczyło mnóstwo sekwencji proroczych . Przepowiednie mogą stanowić nawet od 10 do 20% genomu bakterii, choć wiele z tych przepowiedni jest tajemniczych i znajduje się w stanie mutacyjnego rozkładu . Analiza tych sekwencji ujawniła wiele sposobów kształtowania genomu bakterii gospodarza . Proroctwa mają zdolność wpływania na architekturę genomu gospodarza poprzez zmianę treści genomu, modyfikację organizacji genomu lub zmianę lokalizacji i kolejności genów . Umiarkowane bakteriofagi odgrywają skomplikowaną rolę w generowaniu różnorodności drobnoustrojów i w ewolucji genomów bakteryjnych poprzez pośrednictwo przegrupowania w obrębie chromosomu bakterii iw rezultacie przyczyniają się znacząco do różnic między mózgami w obrębie tego samego gatunku bakterii . Dla porównania, dwa szczepy Streptococcus pyogenes należą do różnych serotypów M i są niezwiązane z różnymi chorobami – ale kiedy te szczepy były porównywane na poziomie DNA, kluczowe różnice korelowały z sekwencjami profage . Inny przykład można zaobserwować w obrębie Campylobacter jejuni, gdzie różnice między mózgami mogą być przypisane do wewnątrzgenomowych inwersji sekwencji DNA podobnych do mu . Porównania między genomami kolinearnymi wykazały, że luki między odpowiednimi genomami przypisywano obecności sekwencji profage lub w wyniku przearanżowanych genomów bakteryjnych . W wielu przypadkach proroctwa o ograniczonej tożsamości sekwencji DNA lub zduplikowane proroctwa służą jako punkty kotwiczenia dla rekombinacji homologicznej . Ponadto proroctwa mogą łączyć się z innymi proroctwa przyczyniając się do ich struktury mozaiki .

Avibacterium paragallinarum jest patogenem zwalczającym kurczęta i powoduje chorobę zakaźną coryza . Filogenetycznie bakteria ta należy do rodziny Pasteurellaceae i była wcześniej znana jako Haemophilus paragallinarum przemianowana w 2005 roku . Rodzina Pasteurellaceae składa się z blisko spokrewnionych bakterii, a w obrębie tej rodziny odnotowano różne bakteriofagi w Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida i Mannheimia haemolytica. W Histophilus somni opisano sekwencje bakteriofagowe . W tym artykule opisujemy pozostałości proroctwa i proroctwa wykryte w Av. paragallinarum.

2. Materiały i metody

2.1. Szczepy bakterii i warunki wzrostu

Av. paragallinarum szczep C-2 (Modesto) otrzymano z produktów biologicznych Onderstepoort, Onderstepoort, Republika Południowej Afryki. Szczep Modesto jest zależny od NAD+ i był hodowany w TM/SN uzupełniony 1% (v/V) surowicą z kurczaka, 1% (v/v) NAD+ i 0,0005% (m / v) roztworem tiaminy i uprawiany w Warunkach ograniczających tlen w słoiku ze świecami w temperaturze 37°C przez 16 godzin .

2.2. Ekstrakcję DNA

genomową ekstrakcję DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu QIAamp DNA Mini firmy Qiagen. Zalecenia producenta były skrupulatnie przestrzegane, z wyjątkiem procedury elucji, w której genomowy DNA był eluowany w 2 × 80 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8.

2.3. Identyfikacja Av. paragallinarum

Av. paragallinarum zostało zidentyfikowane za pomocą protokołu PCR opracowanego specjalnie dla tej bakterii . Dodatkowo, region rybosomalnego DNA 16S (rDNA) został amplifikowany w celu identyfikacji Av. paragallinarum . Otrzymany produkt PCR wycięto z żelu agarozowego, oczyszczono i bezpośrednio zsekwencjonowano w celu uniknięcia ewentualnego obcego skażenia genomowego DNA.

2.4. Genom Assembly and Annotation

genomic DNA samples of Av. paragallinarum szczep C-2 (Modesto) zostały wysłane do Agowa Genomics (obecnie znany jako LGC Genomics), Niemcy, do pirosekwencji tytanu GS-FLX. Sekwencje / odczyty uzyskane z pyrosequencing zostały zmontowane przy użyciu Newbler 2.0.01.14 z 454 Life Sciences Corporation z minimalnym dopasowaniem pokrywającym 90% i minimalnym dopasowaniem pokrywającym 40 zasad. Sekwencje otrzymanych ciągów zostały przekazane do Instytutu J. Craiga Ventera (Jcvi) jako pseudomolekuła do adnotacji. Rurociąg obejmuje wyszukiwanie genów za pomocą glimmera , wyszukiwania BLAST-Extend-Repraze (BER), wyszukiwania ukrytych modeli Markowa (HMM), wyszukiwania ukrytych modeli Markowa Trans membrany (TMHMM), przewidywania sygnałowe i automatyczne adnotacje z AutoAnnotate. Wszystkie te informacje są przechowywane w bazie danych MySQL i powiązanych plikach, które zostały pobrane na naszą stronę. Ręczne narzędzie do adnotacji Manatee zostało pobrane z SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) I używane do ręcznego przeglądania danych wyjściowych z potoku. pDraw32 z oprogramowania ACACLONE został użyty do rysowania map genetycznych dla regionu prophage.

2.5. Numery akcesyjne

AvpmuC-2m (nr akcesyjny: JN627905); HP-2 like prophages contig a (JN627906), B (JN627907) i C (JN627908); lamboid prophage fragments (accession nos.: JN627909-JN627919); prophage integrase genes (accession nos.: JN627920-JN627928).

3. Wyniki i dyskusja

cały projekt sekwencjonowania genomu Av. paragallinarum dało całkowitą liczbę 160 743 odczytów / sekwencji poprzez chemię pirosekwencjonowania. Całkowita liczba stożków zmontowanych z tych sekwencji wynosiła 300, przy czym największy contig zawierający 78 465 bp, a średni rozmiar contig dłuższy niż 500 bp wynosił 10 727 bp. Zamknięty Genom nie mógł być zmontowany dla Av. paragallinarum z wyników sekwencjonowania uzyskanych w wyniku powtarzania sekwencji, które istniały na końcu (- ach) stygów lub w wyniku przerw w sekwencji między stygami. Cząsteczkę pseudogenomu zmontowano z 300 otrzymanych stygów i wysłano do JCVI w celu adnotacji genomu. Wyniki adnotacji wykazały, że łącznie 7% lub 141 otwartych ramek odczytu zostało przypisanych do funkcji białka fagowego. 141 otwartych ramek odczytu zidentyfikowano na 60 Z 300 stygów, w których mapowano jeden lub serię genów profage. Zidentyfikowano dziewięć genów integrazy prophage i zmapowano do siedmiu z 60 stygów. Badania nad otwartymi ramkami odczytu przylegającymi do zidentyfikowanych integraz nie ujawniły dodatkowych genów związanych z profagiem, ale raczej geny kodujące białka błonowe; białka metaboliczne; białka rybosomalne; białka funkcji błon komórkowych lub białka eksportu błon. Nie zaobserwowano istotnej homologii między integrazami.

geny proroctwa podobne Do Mu zostały zidentyfikowane i zmapowane do 11 różnych stygów. 11 stygów porównano z mapą genomu fagów podobnych do Mu, opisaną przez . Tutaj proponujemy przypuszczalny Prorok podobny do Mu dla Av. paragallinarum, AvpmuC-2m (Rys. 1). Duża część genu Mu (25) została zidentyfikowana na pojedynczym kontigu zawierającym 27, 107 bp. Zidentyfikowano dwa dodatkowe styki kończące mapę proroctwa podobnego do Mu dla Av. paragallinarum.

Rysunek 1

przypuszczalna reprezentacja genomu AvpmuC-2m. trzy styki, które zostały użyte do budowy AvpmuC-2m są oddzielone przez //. Rozmiary Contig są podane pod każdym contig w parach zasad.

czterdzieści jeden genów lamboidalnych zmapowano do 11 różnych stygów (rycina 2). Z danymi dostępnymi z całego projektu sekwencjonowania genomu nie można było stwierdzić, czy lamboid prophage jest kompletny lub czy przeszedł masową utratę funkcjonalnego DNA, powodując fragmentację genomu bakteriofagowego i ostatecznie prowadząc do jego zaniku .

Rysunek 2

Różne geny lambda zostały zmapowane do stygów, z których zostały zidentyfikowane i pogrupowane zgodnie z powiązanymi funkcjami . Początki i końce styków są oznaczone przez//.

kompletny lizogen umiarkowanego faga został zidentyfikowany na pojedynczym contig w obrębie genomu. Sukcesja zidentyfikowanych genów jest podobna do sukcesji H. influenzae HP2. Porównanie nucleotide-to-nucleotide ujawniło słabe podobieństwo między H. influenzae prophage HP2 i zidentyfikowanym prophage. Zidentyfikowany Prorok jest zatem unikalny dla Av. paragallinarum. Sugerujemy nazwanie go AvpC-2m-HP2.

dwa dodatkowe stygi również zawierały geny podobne do HP2 (rycina 3). Dalsze badania podobieństwa między zidentyfikowanymi przeciwstawnymi (A, B I C ACPC-2M-HP2) wykazały, że trzy przeciwstawne mają tę samą organizację genomową, ale nie są identyczne.

(a)

(b)

(C)

(a)
(b)
(C)

zidentyfikowano również wiele innych genów prophage, ale nie można ich przypisać do żadnej konkretnej rodziny fagów.

tak więc mapowanie wszystkich odkrytych genów proroctwa pozwoliło nam zasugerować dwa proroctwa w Av. paragallinarum. Jeden Prorok, AvpmyC-2M, przypomina Prorok podobny do Mu, podczas gdy drugi Prorok, AvpC-2M-HP2, przypomina Prorok HP2 H. influenzae.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że nie istnieje konflikt interesów z żadną z nazw handlowych wymienionych w artykule.

podziękowanie

autorzy chcieliby podziękować JCVI za udostępnienie usługi adnotacji JCVI, która dostarczyła im dane do automatycznej adnotacji oraz ręczne narzędzie do adnotacji Manatee.