the escalating pace at which genome sequencing projects are completed has increased the need for high-throughput methods for controlling gene expression. Jednym z możliwych podejść jest zastosowanie antysensownych oligonukleotydów do wiązania mRNA i zapobiegania syntezie białek. Teoretycznie strategia ta pozwala na szybki postęp od syntezy oligomerów do obserwacji fenotypu . W praktyce technologia antysensowna była nękana przez skłonność do niespecyficznych interakcji, a te spowolniły jej szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych . Ostatnio jednak, ulepszenia w chemicznych właściwościach oligonukleotydów i w naszym zrozumieniu ich mechanizmu działania połączyły się, aby ich skuteczne zastosowanie było bardziej prawdopodobne. Prace z wielu laboratoriów sugerują teraz , że oligonukleotydy morfolino mogą być mikroinplikowane do zarodków danio pręgowanego , jeżowca lub xenopusa, gdzie blokują ekspresję genów i wywołują efekty fenotypowe we wczesnych stadiach rozwoju.

Oligonukleotydy Morfolino są niejonowymi analogami DNA dostępnymi w Gene Tools LLC . Posiadają zmienione połączenia szkieletowe w porównaniu z DNA lub RNA (rys. (Rys. 1).1). Pomimo zmiany szkieletu morfolinos wiąże się z komplementarnymi sekwencjami kwasu nukleinowego przez parowanie Zasady Watsona-Cricka. Wiązanie to nie jest mocniejsze niż Wiązanie analogicznych oligomerów DNA i RNA, co wymaga zastosowania stosunkowo długich 25-zasadowych morfolinos do hamowania genów antysensownych. Szkielet sprawia, że morfolinos jest odporny na trawienie przez nukleazy. Ponadto, ponieważ kręgosłup nie ma ładunku ujemnego, uważa się, że morfolinos rzadziej oddziałuje nieselektywnie z białkami komórkowymi; takie interakcje często zaciemniają obserwację fenotypów informacyjnych. Mocne strony morfolinos jako narzędzia do badania rozwoju kręgowców są dobrze opisane w ostatnim przeglądzie Ekkera . Ich największą zaletą jest to, że fenotypy można szybko zaobserwować u zwierząt F0 przy użyciu stosunkowo niedrogiej metody.

struktury DNA i oligonukleotydów morfolino. R i R’ oznaczają kontynuację łańcucha oligomeru w kierunku odpowiednio 5 'lub 3′.

główną przeszkodą w stosowaniu antysensownych oligonukleotydów jest wybór sekwencji docelowej. Antysensowne oligonukleotydy zawierające DNA mogą tworzyć hybrydy RNA-DNA. Hybrydy te mogą działać jako substrat dla RNazy H, która sprzyja rozszczepianiu celu mRNA. Ponieważ RNA jest zdegradowany, każda sekwencja w obrębie regionu kodującego docelowego genu może być użytecznym miejscem antysensownym. Morfolinos natomiast tworzy hybrydy RNA-morpholino, które nie są substratami dla RNazy H, a zatem mRNA nie ulega degradacji. Jest to ważna uwaga, ponieważ morfolinos skierowany do większości regionu kodującego zostanie przesunięty przez rybosom podczas translokacji wzdłuż mRNA, a zatem będzie nieskuteczny w zapobieganiu translacji. Oligonukleotydy Morpholino skierowane do regionu 5 ’ – nieprzetłumaczonego (UTR) lub kodonu start mogą działać preferencyjnie, uniemożliwiając Wiązanie maszyn translacyjnych, ale nie ma gwarancji, że jest to ogólna zasada i będzie to musiało zostać wykazane empirycznie dla każdego docelowego genu.

Ekker i współpracownicy donoszą, że fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydy morfolino mogą być wstrzykiwane do zarodków danio pręgowanego w stadium kuli i osiągnąć równomierny rozkład. Oligomery morfolino ukierunkowane na kodon Startowy Dla Zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) zablokowały ekspresję GFP, podczas gdy oligomery kontrolne, które są komplementarne do GFP, nie. Poziom mRNA GFP nie został zmieniony, co jest zgodne z oczekiwaniami, jeśli Rnaza H nie jest zaangażowana. Te eksperymenty modelowe są znaczące, ponieważ ustalają zdolność oligomerów morfolino do jednoznacznego blokowania ekspresji genów w sposób specyficzny dla sekwencji. Ekker i współpracownicy zgłaszają również hamowanie kilku endogennych genów danio pręgowanego i rozpoczęli opracowywanie bazy danych wyszczególniającej fenotypy wytwarzane przez oligonukleotydy morfolino .

ścieżki badane przez Ekkera i współpracowników przy użyciu morpholinos obejmują sygnalizację rozwoju poprzez ligand Sonic hedgehog i wpływ ekspresji genu angiogennego czynnika wzrostu VEGF-a na angiogenezę. Ogólnie rzecz biorąc, Laboratorium Ekkera zaobserwowało interesujące fenotypy w 16 z 17 genów docelowych . Hammerschmidt i współpracownicy zbadali morfolinos ukierunkowany na gen receptora kinazy serynowo-treoninowej typu i Alk8/Lost-a-fin. Lin i współpracownicy donoszą, że hamowanie morfolinos fez, które koduje białko palca cynkowego, może zmniejszyć ekspresję dlx2, która koduje białko zawierające homeodomainę, w brzusznym przodomózgowiu. Tam, gdzie badano poziom ekspresji, uzyskano znaczące „knockdown” ekspresji genów (do 90%).

w organizmach innych niż danio pręgowany, Angerer i współpracownicy wykorzystali morfolinos zaprojektowany do blokowania translacji SpKr1, czynnika transkrypcyjnego docelowego dla regulacji β-kateniny, w zarodkach jeżowców . Podobnie jak w przypadku pracy Naseviciusa i wsp. , „knockdown” ekspresji GFP zastosowano jako kontrolę pozytywną, a wprowadzenie morfoliny 4 µM anty-SpKr1 spowodowało niepowodzenie różnicowania endodermy. Heasman i in. badali sygnalizację β-kateniny w Xenopus . Wstrzyknięcie w stadium 2-lub 4-komórkowym blokuje tworzenie osi grzbietowej, podczas gdy wstrzyknięcie w stadium 8-komórkowym blokuje tworzenie głowy . Ostatecznie Erickson i współpracownicy wykorzystali elektroporację do dostarczania morfolinos skierowanych przeciwko FoxD3 do zarodków kurzych. FoxD3 jest czynnikiem transkrypcyjnym klasy skrzydlatej helisy, a wprowadzenie morfolinos zmienia postęp komórek Neural-crest, wynik zgodny z lokalizacją FoxD3 . Eksperymenty te ilustrują potencjał morfolinos do dokładnego zbadania czasowego postępu rozwoju. Blokując gen o nieznanej funkcji lub obserwując nieprzewidziany wynik, należy jednak pamiętać, że nowy fenotyp niekoniecznie wynika z redukcji ekspresji genu docelowego. Zastrzeżenie to występuje również w przypadku standardowych knockoutów genetycznych i po prostu oznacza, że wyniki należy interpretować ostrożnie.

te dane są prowokacyjne i sugerują, że przynajmniej w tych modelach zwierzęcych, antysensowne oligomery morfolino mogą stać się rutynowym narzędziem do generowania zmutowanych fenotypów. Ważne jest jednak, aby zdać sobie sprawę, że technologia antysensowna rzadko, jeśli w ogóle, duplikuje kompletne mutacje „utraty funkcji”. Ostrzegamy również, że odczynniki antysensowne były powszechnie nadużywane w przeszłości. Brak kontroli, wyniki są często marginalne, a obserwowane fenotypy często okazały się być spowodowane szeroką gamą nieoczekiwanych mechanizmów nie-antysensownych. Przyczyny tych nie-antysensownych efektów obejmują niezamierzone interakcje z białkami i wiązanie się z niedocelowymi sekwencjami kwasu nukleinowego . Dlatego konieczne jest, aby metodologia była ostrożnie stosowana, aby uniknąć powtarzania błędów z przeszłości, które spowolniły postęp technologii antysensownej.

podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu antysensownego, rygorystyczne kontrole niespecyficznych efektów mają kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji fenotypów. Eksperymenty z użyciem oligonukleotydów morfolino powinny zawsze testować co najmniej jedno niedopasowanie i jeden jajeczkowany oligomer kontrolny, a wyniki tych testów powinny być zgłaszane. Ważne są również testy dawka-odpowiedź w celu określenia marginesu między indukcją określonego fenotypu a początkiem toksyczności. Na przykład margines ten może być mniejszy niż podwójny, podkreślając potrzebę starannie kontrolowanego określania dawki i precyzyjnie ilościowego dostarczania. O ile to możliwe, poziomy zarówno białka docelowego, jak i jednego lub więcej białek kontrolnych powinny być oceniane w próbkach poddanych morfolinom doświadczalnym i kontrolnym. Ponadto Ekker sugeruje, aby wyniki były potwierdzane przez ratowanie mRNA i/lub przez porównanie z fenotypami istniejących mutantów .

wysoki wskaźnik sukcesu w hamowaniu ekspresji genów przez oligonukleotydy morfolino jest zaskakujący. Dogmat w dziedzinie antysensownych jest taki, że celowanie w miejsce startu ATG nie jest pewną receptą na sukces i że aż 40 oligonukleotydów może wymagać przetestowania, aby zidentyfikować taki, który skutecznie hamuje ekspresję genów . Skoro kodon startowy działa tak dobrze, dlaczego więcej śledczych nie robi tego zamiast uciekać się do skomplikowanych ekranów? Morfolinos może być bardziej skuteczny niż inne antysensowne chemikalia, ale dlaczego? Ta ostatnia kwestia będzie musiała zostać rozwiązana poprzez systematyczne badanie ich właściwości i porównanie z innymi typami oligonukleotydów. Dramatycznie zmieniony szkielet morpholino może skuteczniej wiązać się z mRNA lub działać jako lepszy blok do translacji. Jeśli tak, morfolinos może być nadrzędnym czynnikiem hamującym geny w stosunku do innych typów oligomerów, które mogą blokować translację, takich jak zablokowany kwas nukleinowy (LNA), peptydowy kwas nukleinowy (pna) lub zmodyfikowany 2’RNA . Z drugiej strony, inne rodzaje oligomerów mogą działać równie dobrze, lub lepiej niż morfolinos, ale ich potencjał może być mniej widoczny, ponieważ nie zostały przetestowane w korzystnych systemach eksperymentalnych.

mylące obserwacje wynikające z niespecyficznych interakcji pomieszały wiele wcześniejszych badań z wykorzystaniem oligonukleotydów . Trudności te skłoniły wielu badaczy do sceptycznego stosowania oligonukleotydów jako narzędzia do badań podstawowych. Prace opublikowane w ciągu ostatnich 18 miesięcy sugerują jednak, że oligomery morfolino mogą mieć właściwości, które pozwalają badaczom rutynowo generować pouczające fenotypy. Wyniki są ekscytujące, z implikacją, że oligomery morfolino mogą stanowić powszechnie stosowane narzędzie do genetyki chemicznej i genomiki funkcjonalnej. Aby zrealizować ten potencjał, należy określić właściwości, które regulują skuteczność tych odczynników. Informacje te umożliwią badaczom optymalizację metodologii i osiągnięcie maksymalnego „knockdown” danego celu przy jednoczesnym zminimalizowaniu zakłócających, niespecyficznych efektów. Użytkownicy oligomerów morpholino muszą zrozumieć problemy, które nękały antysensowne pole w przeszłości, uczyć się na tych niepowodzeniach i przeprowadzać odpowiednie eksperymenty kontrolne. Te eksperymenty kontrolne, co najmniej tak samo jak produkcja interesujących fenotypów, ustalą, czy oligonukleotydy morfolino są przełomem, który sugerują ostatnie badania.