Resumo

Bacteriana sequenciamento do genoma foi entregue uma abundância de prophage sequências como um produto e a análise destas seqüências revelou maneiras em que os fagos têm afetado o genoma de seu hospedeiro de bactérias em diferentes espécies bacterianas. O objetivo deste estudo foi identificar as sequências relacionadas com fagos no rascunho da montagem do genoma Avibacterium paragallinarum, o agente causador da coryza infecciosa em aves de capoeira. Toda a montagem do genoma não foi possível devido à presença de lacunas e/ou repetições existentes nas extremidades dos contigs. No entanto, a anotação do genoma revelou sequências proféticas e remanescentes de profecias presentes neste genoma. A partir dos resultados obtidos, uma completa Mu-como um bacteriófago poderia ser identificado de que foi denominado AvpmuC-2M. Uma sequência completa de HP2-como um bacteriófago, chamado AvpC-2M-HP2, também foi identificado.

1. Os bacteriófagos foram descobertos pela primeira vez na Inglaterra, em 1915, por Frederick W. Twort e independentemente em 1917 por Felix D’Herelle no Instituto Pasteur em Paris . Os bacteriófagos são vírus que infectam bactérias e podem ser divididos em dois grupos de acordo com os seus meios de interacção com a célula bacteriana, nomeadamente, as fagens líticas (virulentas) e temperadas (lisogénicas). Phages líticos procedem tipicamente com replicação no momento depois de infectar a célula hospedeira, onde um grande número de novos vírus são liberados através da lise da célula hospedeira. Fagos temperados não, necessariamente, iniciar a replicação imediatamente após a infecção, e dependendo de uma série de condições, estes fagos podem integrar o seu cromossoma no genoma da célula hospedeira assim permanecendo em silêncio até induzido . Uma vez que um genoma bacteriófago é integrado no genoma da célula hospedeira, ele é referido como uma profecia. As profecias são os principais suspeitos na adaptação de patógenos existentes a novos hospedeiros ou no surgimento de novos patógenos ou clones epidêmicos . As bactérias não têm ciclo de vida sexual e a troca de alelos dentro de uma população é realizada através da transferência horizontal de genes, e a fonte deste DNA pode ser phages, entre outros . A menos que limitada pela barreira das espécies, unidades funcionais inteiras podem ser importadas destas fontes e o ADN Transferido pode variar entre 1 kb e mais de 100 kb em tamanho e pode codificar estruturas superficiais complexas ou mesmo vias metabólicas inteiras . Há muito tempo que se estabeleceu que os bacteriofagos contribuem para a patogenicidade dos seus hospedeiros bacterianos, uma vez que muitos genes têm demonstrado ser transferidos entre bactérias através de fagos . Estes genes podem codificar para um subconjunto diverso de fatores de virulência, tais como a toxina, fatores regulatórios (que regurgitam a expressão de genes de virulência do hospedeiro), e enzimas, que podem alterar os componentes de virulência bacteriana .a sequenciação do genoma bacteriano completo produziu uma abundância de sequências proféticas . As profecias podem constituir até 10 a 20% do genoma de uma bactéria, embora muitas dessas profecias sejam crípticas e em um estado de decadência mutacional . A análise dessas sequências revelou inúmeras maneiras em que as profecias moldam o genoma de suas bactérias hospedeiras . As profecias têm a capacidade de afetar a arquitetura do genoma do hospedeiro, alterando o conteúdo do genoma, modificando a organização do genoma, ou alterando a localização e a ordem dos genes . Temperado bacteriófagos desempenhar um papel complexo na geração de diversidade microbiana e na evolução dos genomas bacterianos através da mediação de rearranjo dentro do cromossomo bacteriano e, como resultado, eles contribuem significativamente para a interstrain diferenças dentro de uma mesma espécie bacteriana . Em comparação, duas estirpes de Streptococcus pyogenes pertencem a serótipos M diferentes e estão sem ligação com doenças diferentes—mas quando estas estirpes foram comparadas a nível do ADN, as principais diferenças correlacionadas com as sequências proféticas . Outro exemplo pode ser observado dentro de Campylobacter jejuni, onde as diferenças entre cérebros podem ser atribuídas a inversões intra-genômicas de sequências de DNA profetizado do tipo Mu . Comparações entre genomas colineares mostraram que as diferenças entre os genomas relevantes foram atribuídas à presença de sequências proféticas ou como resultado de genomas bacterianos rearranjados . Em muitos casos, profecias com identidade de sequência de DNA limitada ou profecias duplicadas servem como pontos de ancoragem para recombinação homóloga . Além disso, profecias podem recombinar – se com outras profecias contribuindo para a sua estrutura mosaica . Avibacterium paragallinarum é um agente patogénico que ataca galinhas e está a causar a doença infecciosa coryza . Filogeneticamente esta bactéria pertence à família Pasteurellaceae e foi anteriormente conhecida como Haemophilus paragallinarum renomeada em 2005 . A família Pasteurellaceae é constituída por bactérias estreitamente relacionadas e, nesta família, foram notificados vários bacteriófagos em Haemophilus influenzae, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella multocida e Mannheimia haemolytica. Foram notificadas sequências bacteriofágicas em Histophilus somni . Neste artigo, descrevemos os restos proféticos e proféticos detectados na Av. paragallinarum.2. Materiais e métodos

2.1. Estirpes bacterianas e Condições de crescimento

Av. a estirpe C-2 do paragallinarum (Modesto) foi obtida a partir de Onderstepoort Biological Products, Onderstepoort, África do Sul. A estirpe Modesto é NAD+ dependente e foi cultivada em TM/SN complementada com 1% (v/v) de soro de galinha, 1% (v/v) NAD+ e 0,0005% (m/v) de solução de tiamina e cultivada em condições limitadoras de oxigénio num frasco de velas a 37°C durante 16 h.

2, 2. A extracção do ADN

foi realizada com a utilização de um Mini-kit de ADN QIAamp de Qiagen. As recomendações do fabricante foram meticulosamente seguidas, exceto para o procedimento de eluição onde o DNA genômico foi eluído em 2 × 80 µL 10 mM Tris-HCl, pH 8.

2, 3. Identificação de Av. paragallinarum

Av. paragallinarum foi identificado usando um Protocolo PCR desenvolvido especificamente para esta bactéria . Além disso, a região 16S ribosomal DNA (rDNA) foi amplificada a fim de identificar Av. paragallinarum . O produto PCR obtido foi excisado do gel de agarose, purificado e directamente sequenciado para evitar qualquer possível contaminação do ADN genómico estranho.

2, 4. Genoma Assembly and Annotation

Genomic DNA samples of Av. paragallinarum estirpe C-2 (Modesto) foi enviada para Agowa Genomics (atualmente conhecida como LGC Genomics), Alemanha, para a pirosequenciação de titânio GS-FLX. Sequências / leituras obtidas a partir da pirosequenciação foram montadas usando Newbler 2.0.01.14 da 454 Life Sciences Corporation com uma identidade mínima de correspondência de 90% e um comprimento mínimo de correspondência de sobreposição de 40 bases. As sequências de contigs obtidos foram submetidas ao Instituto J. Craig Venter (JCVI) como pseudomolécula para anotação. O pipeline inclui pesquisas de genes com Glimmer , BLAST-Extend-Repraze (BER), Hidden Markov Models (HMM), Trans Membrane Hidden Markov Models (TMHMM), signalp predictions, and automatic annotations from AutoAnnotate. Todas estas informações são armazenadas em um banco de dados MySQL e arquivos associados que foram baixados para o nosso site. O manual annotation tool Manatee foi baixado do SourceForge (http://manatee.sourceforge.net/) e usado para rever manualmente a saída do pipeline. o pDraw32 do software ACACLONE foi usado para desenhar mapas genéticos para a região profética.

2, 5. Número de adesão

AvpmuC-2M (n ° de adesão): JN627905); PS-2 como prophages UM contig (JN627906), B (JN627907), e C (JN627908); lamboid prophage fragmentos de adesão nº.: JN627909-JN627919); prophage integrase genes (adesão nº.: JN627920-JN627928).

3. Resultados e discussão

todo o projecto de sequenciação do genoma da Av. paragallinarum rendeu um número total de 160 743 leituras/sequências através da química de pirosequenciamento. O número total de contigs montados a partir destas sequências foi de 300, com o maior contig compreendendo 78 465 bp e a dimensão média da contig superior a 500 BP era de 10 727 bp. Um genoma fechado não poderia ser montado para Av. paragallinarum from the sequencing results obtained due to repeat sequences that existed on the end(s) of contigs or as a result of sequence gaps between contigs. Uma molécula pseudogenome foi montada a partir dos 300 contigs obtidos e foi enviada para a JCVI para a anotação do genoma. Os resultados da anotação indicaram que um total de 7% ou 141 quadros de leitura abertos foram atribuídos a funções proteicas fagadas. Os 141 frames de leitura aberta foram identificados em 60 dos 300 contigs onde um ou uma série de genes de profecia foram mapeados. Nove genes integrais de prophage foram identificados e mapeados para sete dos 60 contigs. Investigações em quadros de leitura abertos adjacentes às integrases identificadas não revelaram genes adicionais relacionados com profecias, mas sim genes que codificam proteínas de membrana; proteínas metabólicas; proteínas ribossómicas; proteínas de função da membrana celular ou proteínas de exportação de membrana. Não foi observada homologia significativa entre as integrases. genes proféticos semelhantes a um Mu foram identificados e mapeados em 11 contigs diferentes. Os 11 contigs foram comparados com o mapa do genoma de fagos Tipo Mu relatado por . Aqui sugerimos uma putativa profecia Mu-like para Av. paragallinarum, AvpmuC-2m (Figura 1). Uma grande parte do gene Mu (25) foi identificada em um único contig compreendendo 27, 107 bp. Dois contigs adicionais foram identificados completando o mapa de uma profecia Mu-like para Av. paragallinarum.

Figura 1

Putativo genoma representação de AvpmuC-2M. Os três contigs que foram utilizados na construção de AvpmuC-2M estão separados por //. Os tamanhos de Contig são indicados sob cada contig em pares de base.

quarenta e um genes lambóides foram mapeados para 11 contigs diferentes (Figura 2). Com os dados disponíveis de todo o projecto de sequenciamento do genoma, não foi possível concluir se a profecia lambóide está completa ou se sofreu uma perda maciça de ADN funcional que resultou na fragmentação do genoma bacteriófago e que, em última análise, levou ao seu desaparecimento .

Figura 2

Lamboid genética representação. Vários genes lambda foram mapeados para os contigs a partir dos quais foram identificados e agrupados de acordo com as funções associadas . Inícios e fins dos contigs são indicados por //.

um lisogénio completo de uma fagina temperada foi identificado num único contig dentro do genoma. A sucessão dos genes identificados é semelhante à da profecia de H. influenzae HP2. Uma comparação entre nucleótidos e nucleótidos revelou uma fraca semelhança entre a profecia de H. influenzae HP2 e a profecia identificada. A profecia identificada é, portanto, única para Av. paragallinarum. Sugerimos chamar-lhe AvpC-2M-HP2.

dois contigs adicionais também continham genes do tipo HP2 (Figura 3). Investigações adicionais de similaridade entre os contigs identificados (A, B E C De AcpC-2M-HP2) indicaram que os três contigs compartilham a mesma organização genômica, mas não são idênticos.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

HP2-como prophage genética representação. Os vários contigs (a), (b) e (c) Carregando quadros de leitura abertos do tipo HP2 são ilustrados dentro deste diagrama. Uma profecia HP2 completa AvpC-2m-HP2 foi identificada no genoma da Av. paragallinarum Modesto representado por (c) neste diagrama.

uma abundância de outros genes proféticos também foram identificados, mas não podem ser atribuídos a qualquer família específica de fagias ou fagias. assim, o mapeamento de todos os genes proféticos descobertos permitiu-nos sugerir duas profecias em Av. paragallinarum. Uma profecia, AvpmyC-2M, assemelha-se a uma profecia Tipo Mu, enquanto a outra profecia, AvpC-2m-HP2, assemelha-se à profecia HP2 de H. influenzae.

conflito de interesses

os autores declaram que não existe conflito de interesses com qualquer uma das identidades comerciais mencionadas no papel.

agradecimentos

os autores gostariam de agradecer a JCVI por fornecer o serviço de anotação JCVI que lhes forneceu dados de anotação automática e o Manateu da ferramenta de anotação manual.