Das zunehmende Tempo, mit dem Genomsequenzierungsprojekte abgeschlossen werden, hat den Bedarf an Hochdurchsatzmethoden zur Kontrolle der Genexpression erhöht. Ein möglicher Ansatz ist die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, um mRNA zu binden und die Proteinsynthese zu verhindern. Theoretisch ermöglicht diese Strategie einen schnellen Fortschritt von der Synthese von Oligomeren bis zur Beobachtung des Phänotyps . In der Praxis wurde die Antisense-Technologie von einer Neigung zu unspezifischen Wechselwirkungen geplagt, die ihre breite Anwendung auf biologische Untersuchungen verlangsamt haben . In jüngster Zeit haben jedoch Verbesserungen der chemischen Eigenschaften von Oligonukleotiden und unseres Verständnisses ihres Wirkmechanismus dazu geführt, dass ihre erfolgreiche Verwendung wahrscheinlicher wird. Arbeiten aus einer Reihe von Labors legen nun nahe, dass Morpholino-Oligonukleotide in Zebrafisch- , Seeigel- oder Xenopus-Embryonen mikroinjiziert werden können , wo sie die Genexpression blockieren und phänotypische Effekte in den frühen Entwicklungsstadien hervorrufen.

Morpholino-Oligonukleotide sind nichtionische DNA-Analoga, die von Gene Tools LLC erhältlich sind. Sie besitzen im Vergleich zu DNA oder RNA veränderte Rückgratverknüpfungen (Abbildung (Abbildung 1).1). Trotz ihres veränderten Rückgrats binden Morpholinos durch Watson-Crick-Basenpaarung an komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Diese Bindung ist nicht enger als die Bindung analoger DNA- und RNA-Oligomere, was die Verwendung relativ langer 25-Basen-Morpholinos zur Antisense-Genhemmung erforderlich macht. Das Rückgrat macht Morpholinos resistent gegen die Verdauung durch Nukleasen. Da das Rückgrat keine negative Ladung hat, wird angenommen, dass Morpholinos weniger wahrscheinlich nicht selektiv mit zellulären Proteinen interagieren; Solche Wechselwirkungen verdecken oft die Beobachtung informativer Phänotypen. Die Stärken von Morpholinos als Werkzeuge zur Untersuchung der Wirbeltierentwicklung sind in einem kürzlich erschienenen Review von Ekker gut beschrieben . Ihr größter Vorteil ist, dass Phänotypen bei F0-Tieren mit einer relativ kostengünstigen Methode schnell beobachtet werden können.

Strukturen von DNA und Morpholino-Oligonukleotiden. R und R‘ bedeuten eine Fortsetzung der Oligomerkette in 5′- bzw. 3′-Richtung.

Ein Haupthindernis für die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden ist die Wahl einer Zielsequenz. Antisense-Oligonukleotide, die DNA enthalten, können RNA-DNA-Hybride bilden. Diese Hybride können als Substrat für RNase H wirken, was die Spaltung des mRNA-Targets fördert. Da die RNA abgebaut wird, hat jede Sequenz innerhalb der kodierenden Region des Zielgens das Potenzial, eine nützliche Antisense-Stelle zu sein. Im Gegensatz dazu bilden Morpholinos RNA-Morpholino-Hybride, die keine Substrate für RNase H sind, und somit wird die mRNA nicht abgebaut. Dies ist eine wichtige Überlegung, da Morpholinos, die auf den größten Teil der kodierenden Region abzielen, durch das Ribosom verdrängt werden, wenn es entlang der mRNA transloziert, und daher bei der Verhinderung der Translation unwirksam sind. Morpholino-Oligonukleotide, die auf die 5′-untranslatierte Region (UTR) oder das Start-Codon abzielen, könnten bevorzugt arbeiten, indem sie die Translationsmaschinerie an der Bindung hindern, aber es gibt keine Garantie dafür, dass dies eine allgemeine Regel ist und empirisch für jedes Zielgen nachgewiesen werden muss.

Ekker und Kollegen berichten, dass fluoreszenzmarkierte Morpholino-Oligonukleotide in Zebrafischembryonen im Anfangsstadium injiziert werden können und eine gleichmäßige Verteilung erreichen. Morpholino-Oligomere, die auf das Start-Codon für grün fluoreszierendes Protein (GFP) abzielten, blockierten die GFP-Expression, während Kontroll-Oligomere, die zu GFP komplementär sind, dies nicht taten. Das Niveau der GFP-mRNA wurde nicht verändert, was zu erwarten ist, wenn RNase H nicht beteiligt ist. Diese Modellexperimente sind bedeutsam, weil sie die Fähigkeit von Morpholino-Oligomeren nachweisen, die Genexpression sequenzspezifisch eindeutig zu blockieren. Ekker und Kollegen berichten auch über die Hemmung mehrerer endogener Zebrafischgene und haben begonnen, eine Datenbank zu erstellen, in der die Phänotypen aufgeführt sind, die von Morpholino-Oligonukleotiden produziert werden .

Zu den von Ekker und Kollegen mit Morpholinos untersuchten Signalwegen gehören die Entwicklungssignalisierung durch den Sonic Hedgehog-Liganden und die Wirkung der VEGF-A-Genexpression des angiogenen Wachstumsfaktors auf die Angiogenese. Insgesamt haben die Ekker-Labor interessante Phänotypen in 16 der 17 Gene gezielt beobachtet . Hammerschmidt und Kollegen haben Morpholinos untersucht, die auf das Typ-I-Serin / Threonin-Kinase-Rezeptorgen Alk8 / Lost-a-fin abzielen. Lin und Mitarbeiter haben berichtet, dass die Hemmung mit Morpholinos von fez, die für ein Zinkfinger-Protein kodiert, die Expression von dlx2, das für ein Homöodomänen-haltiges Protein kodiert, im ventralen Vorderhirn reduzieren kann. Wo Expressionsniveaus untersucht wurden, wurden signifikante ‚Knockdowns‘ der Genexpression (bis zu 90%) erreicht .In anderen Organismen als Zebrafischen haben Angerer und Kollegen Morpholinos verwendet, um die Translation von SpKr1, einem Transkriptionsfaktor-Ziel für die β-Catenin-Regulation, in Seeigelembryonen zu blockieren . Wie bei der Arbeit von Nasevicius et al. wurde ein ‚Knockdown‘ der GFP-Expression als Positivkontrolle verwendet, und die Einführung von 4 µM Anti-SpKr1-Morpholino führte zu einem Versagen des Endoderms zu differenzieren. Heasman et al. haben β-Catenin-Signalisierung in Xenopus untersucht . Die Injektion im 2- oder 4-Zellstadium blockiert die Bildung der Dorsalachse, während die Injektion im 8-Zellstadium die Kopfbildung blockiert . Schließlich haben Erickson und Kollegen Elektroporation verwendet, um Morpholinos, die gegen FoxD3 gerichtet sind, an Hühnerembryonen abzugeben. FoxD3 ist ein Transkriptionsfaktor der Winged-Helix-Klasse, und die Einführung von Morpholinos verändert den Fortschritt von Neuralkammzellen, ein Ergebnis, das mit der Lokalisierung von FoxD3 übereinstimmt . Diese Experimente veranschaulichen das Potenzial für Morpholinos, den zeitlichen Verlauf der Entwicklung fein zu sezieren. Bei der Blockierung eines Gens unbekannter Funktion oder bei der Beobachtung eines unerwarteten Ergebnisses ist jedoch zu beachten, dass der neue Phänotyp nicht notwendigerweise auf eine Verringerung der Expression des Zielgens zurückzuführen ist. Diese Einschränkung gilt auch für genetische Standard-Knockouts und impliziert lediglich, dass die Ergebnisse vorsichtig interpretiert werden sollten.

Diese Daten sind provokativ und legen nahe, dass Morpholino-Antisense-Oligomere zumindest in diesen Tiermodellen zu Routineinstrumenten zur Erzeugung mutierter Phänotypen werden könnten. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass die Antisense-Technologie selten, wenn überhaupt, vollständige Mutationen mit Funktionsverlust dupliziert. Wir warnen auch davor, dass Antisense-Reagenzien in der Vergangenheit häufig missbraucht wurden. Kontrollen fehlten, die Ergebnisse sind oft marginal, und es wurde häufig festgestellt, dass beobachtete Phänotypen auf eine Vielzahl unerwarteter Nicht-Antisense-Mechanismen zurückzuführen sind. Die Ursachen für diese Nicht-Antisense-Effekte umfassen unbeabsichtigte Wechselwirkungen mit Proteinen und die Bindung an Nicht-Ziel-Nukleinsäuresequenzen . Es ist daher unbedingt erforderlich, dass die Methodik sorgfältig angewendet wird, um eine Wiederholung der Fehler der Vergangenheit zu vermeiden, die den Fortschritt der Antisense-Technologie verlangsamt haben.Wie bei jedem Antisense-Experiment sind strenge Kontrollen für unspezifische Effekte entscheidend, um Phänotypen richtig zu interpretieren. Experimente mit Morpholino-Oligonukleotiden sollten immer mindestens ein Mismatch- und ein Scrambled-Kontroll-Oligomer testen, und die Ergebnisse dieser Tests sollten gemeldet werden. Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung des Abstands zwischen der Induktion eines bestimmten Phänotyps und dem Einsetzen der Toxizität sind ebenfalls wichtig. Zum Beispiel kann diese Marge weniger als doppelt so hoch sein, was die Notwendigkeit einer sorgfältig kontrollierten Dosisbestimmung und einer genau quantifizierten Abgabe unterstreicht. Wann immer möglich, sollten die Spiegel sowohl des Zielproteins als auch eines oder mehrerer Kontrollproteine in Proben bewertet werden, die mit experimentellen und Kontroll-Morpholinos behandelt wurden. Darüber hinaus schlägt Ekker vor, die Ergebnisse durch mRNA-Rescue und / oder durch Vergleich mit Phänotypen bestehender Mutanten zu bestätigen .

Die hohe Erfolgsrate bei der Hemmung der Genexpression durch Morpholino-Oligonukleotide ist überraschend. Das Dogma im Antisense-Bereich ist, dass das Targeting der ATG-Startstelle kein bestimmtes Erfolgsrezept ist und dass bis zu 40 Oligonukleotide getestet werden müssen, um eines zu identifizieren, das die Genexpression effizient hemmt . Wenn das Targeting des Start-Codons so gut funktioniert, warum tun dies dann nicht mehr Ermittler, anstatt auf aufwendige Bildschirme zurückzugreifen? Morpholinos sind möglicherweise wirksamer als andere Antisense-Chemikalien, aber warum? Die letztere Frage muss durch systematische Untersuchung ihrer Eigenschaften und Vergleich mit anderen Arten von Oligonukleotiden angegangen werden. Das dramatisch veränderte Morpholino-Rückgrat kann möglicherweise effektiver an mRNA binden oder als besserer Block für die Translation fungieren. Wenn ja, könnten Morpholinos überlegene Mittel für die Genhemmung im Vergleich zu anderen Arten von Oligomeren sein, die die Translation blockieren könnten, wie z. B. gesperrte Nukleinsäure (LNA), Peptidnukleinsäure (PNA) oder 2′-modifizierte RNA . Auf der anderen Seite könnten andere Arten von Oligomeren genauso gut oder besser als Morpholinos funktionieren, aber ihr Potenzial kann weniger offensichtlich sein, weil sie nicht in günstigen experimentellen Systemen getestet wurden.Irreführende Beobachtungen, die aus unspezifischen Wechselwirkungen resultieren, haben viele frühere Forschungen mit Oligonukleotiden verwirrt . Diese Schwierigkeiten haben dazu geführt, dass viele Forscher der Verwendung von Oligonukleotiden als Instrument für die Grundlagenforschung skeptisch gegenüberstehen. Arbeiten, die in den letzten 18 Monaten veröffentlicht wurden, legen jedoch nahe, dass Morpholino-Oligomere Eigenschaften haben können, die es Forschern routinemäßig ermöglichen, lehrreiche Phänotypen zu erzeugen. Die Ergebnisse sind spannend, mit der Implikation, dass morpholino-Oligomere könnte ein allgemein anwendbares Werkzeug für die chemische Genetik und funktionelle Genomik. Um dieses Potenzial zu realisieren, müssen die Eigenschaften bestimmt werden, die die Wirksamkeit dieser Reagenzien bestimmen. Diese Informationen werden es den Forschern ermöglichen, die Methodik zu optimieren und einen maximalen Knockdown eines bestimmten Ziels zu erreichen, während störende, unspezifische Effekte minimiert werden. Anwender von Morpholino-Oligomeren müssen die Probleme verstehen, die das Antisense-Feld in der Vergangenheit geplagt haben, aus diesen Rückschlägen lernen und entsprechende Kontrollexperimente durchführen. Diese Kontrollexperimente, mindestens so viel wie die Produktion interessanter Phänotypen, werden bestimmen, ob Morpholino-Oligonukleotide der Durchbruch sind, den die jüngste Forschung nahelegt.