fotobleaching-ilmiö (jota yleisesti kutsutaan myös haalistumiseksi) tapahtuu, kun fluorofori pysyvästi menettää Fluoresointikykynsä fotonin aiheuttaman kemiallisen vaurion ja kovalenttisen modifikaation vuoksi. Siirryttäessä viritetystä singlettitilasta viritettyyn triplettitilaan fluoroforit voivat vuorovaikuttaa toisen molekyylin kanssa tuottaen peruuttamattomia kovalenttisia modifikaatioita. Triplettitila on suhteellisen pitkäikäinen suhteessa singlettitilaan, mikä mahdollistaa innostuneiden molekyylien paljon pidemmän aikajakson käydä läpi kemiallisia reaktioita komponenttien kanssa ympäristössä. Tietylle fluoriforille ennen valoherkistymistä tapahtuvien eksitaatio-ja emissiosyklien keskimääräinen lukumäärä riippuu molekyylirakenteesta ja paikallisesta ympäristöstä. Jotkut fluoriforit valkaisevat nopeasti päästettyään vain muutaman fotonin, kun taas toiset, jotka ovat lujempia, voivat käydä läpi tuhansia tai miljoonia syklejä ennen valkaisua. Tämä interaktiivinen opetusohjelma tutkii fotobleaching hinnat yhden, kaksi, ja moninkertaistaa merkitty fluoresenssi näytteitä.

opetusohjelma alustaa parilla identtistä fluoresenssikuvaa, jotka näkyvät Valkaisemattomassa kuvassa ja Fotobleached Kuvaikkunoissa. Jotta voit käyttää opetusohjelma, klikkaa Suljin painiketta avata virtuaalisen suljin ja anna Photobleached Kuvan haalistua tai photobleach suuresti liioiteltu määrä ajan kuluessa. Häipyminen voidaan pysäyttää milloin tahansa napsauttamalla tauko-painiketta (josta tulee Käynnistä-painiketta), ja sitten jatketaan klikkaamalla Käynnistä-painiketta. Kaksois-ja kolmoismerkityissä yksilöissä eri yksittäisiä fluoriforivalkaisunopeuksia voidaan tarkastella erikseen Värikanavat-valintaruuduilla (oletusasetus on kaikki kanavat päällä). Esimerkiksi klikkaamalla punaista valintaruutua näytteelle, jossa on kolminkertainen merkintä, näkyy vain punainen värikanava. Joko kaksi tai kaikki kolme värikanavaa voidaan sekoittaa keskenään moninkertaisesti merkittyihin näytteisiin lisää-valintaruudun avulla. Uusi yksilö voidaan valita Choose a Specimen pull-down-valikosta. Näytteiden nimet sisältävät seuraavat fluoriforeiden merkintätiedot: FITC, fluoreseiini-isotiosyanaatti; kolminkertainen, punainen, vihreä ja sininen fluorofori; Dual, kaksi fluoroforia; DAPI, 4′, 6-diamidino-2-fenyyli-indoli; MitoTracker, mitokondrio-anturi; Alexa 488, vihreä fluorofori; ja Auto, autofluoresenssi. Opetusohjelma on suunniteltu muuttamaan satunnaisesti yksittäisten fluoriforeiden valonläpäisynopeuksia uudelleenlatauksen yhteydessä niin, että suljinpainikkeen napsauttaminen toistuvasti osoittaa, miten kuva näkyy fluoresenssin valkaisunopeuden muuttuessa kunkin värisignaalin osalta.

koska fotobleaching, hyvin huonosti ymmärretty ilmiö, johtaa dramaattiseen fluoresenssiemissioiden intensiteetin vähenemiseen useimmissa näytteissä, artefaktin kontrollointi on ratkaisevan tärkeää, jotta tyydyttävät kuvat saadaan otettua onnistuneesti. Esimerkkinä tyypilliselle fluorokromille fluoreseiinin fotobleaching-kvanttituotto keskivahvalla tai suurella valaistusvoimakkuudella määrää, että keskimääräinen molekyyli säteilee 30-40 tuhatta fotonia käyttöikänsä aikana (ennen kuin se lamaantuu pysyvästi). Lisäksi eksitaatio-ja emissiosyklien määrä on vakio tietylle fluoriforille riippumatta siitä, miten eksitaatioenergia toimitetaan, joko erillisinä pulsseina tai jatkuvan valaistuksen avulla. Siksi herätevalon vähentäminen neutraalien tiheyssuodattimien avulla ei estä valonheittoa, se vain vähentää nopeutta.

kuvassa 1 esitetty on tyypillinen esimerkki fotobleaching (häipyminen) havaittu sarja digitaalisia kuvia otettu eri ajankohtina moninkertaisesti värjätty kryostaatin ohut osa (16 mikrometriä) hiiren suolistossa. Tumat värjättiin Sytoksinvihreällä (vihreä fluoresenssi), kun taas pikarinsolujen lima ja harjan reunuksen filamenttinen aktiini värjättiin Alexa Fluor 350 vehnänalkio agglutiniinilla (sininen fluoresenssi) ja Alexa Fluor 568 falloidiinilla (punainen fluoresenssi). Aikapisteet otettiin kahden minuutin välein käyttäen fluoresenssisuodattimen yhdistelmää, jonka kaistanleveydet oli viritetty herättämään kolme fluoriforia samanaikaisesti ja samalla tallentamaan yhdistetyt emissiosignaalit. Huomaa, että kaikki kolme fluoriforia ovat suhteellisen voimakkaita kuvassa 1(a), mutta Alexa Fluor 350 ja 568 (sininen ja punainen) intensiteetit alkavat pudota nopeasti kahden minuutin kohdalla ja ovat lähes kokonaan poissa kuuden minuutin kohdalla. Vihreäksi värjätyt ytimet kestävät paremmin valonheittoa, mutta myös niiden voimakkuus laskee tasaisesti ajastetun sekvenssin (10 minuuttia) aikana. Laaja valikoima synteettisiä antifade-reagensseja vähentää merkittävästi valonläpäisyn nopeutta.

tärkeä luokka fotobleaching tapahtumat ovat fotodynaamisia, eli niihin liittyy fluoroforin vuorovaikutus valon ja hapen yhdistelmän kanssa. Fluoriforeiden ja molekyylihapen väliset reaktiot tuhoavat pysyvästi fluoresenssin ja tuottavat vapaan radikaalin singlet-happilajin, joka voi kemiallisesti muokata muita molekyylejä elävissä soluissa. Fotodynaamisista tapahtumista johtuva valoherkkyyden määrä on molekyylitason happipitoisuuden ja proksimaalisen etäisyyden funktio fluoriforin, happimolekyylien ja muiden solukomponenttien välillä. Valoherkkyyttä voidaan vähentää rajoittamalla fluoriforioiden valotusaika valaistukseen tai alentamalla heräteenergiaa. Nämä tekniikat kuitenkin vähentävät myös mitattavissa olevaa fluoresenssisignaalia. Monissa tapauksissa fluoriforien tai solususpensioiden liuokset voidaan deoksigenoida, mutta tämä ei ole mahdollista eläville soluille ja kudoksille. Ehkä paras suoja valoherkistymistä vastaan on rajoittaa fluorokromin altistumista voimakkaalle valaistukselle (neutraalien tiheyssuodattimien avulla) ja käyttää harkiten kaupallisesti saatavilla olevia antifade-reagensseja, joita voidaan lisätä asennusliuokseen tai soluviljelyaineeseen.

tietyissä olosuhteissa valoherkistävää vaikutusta voidaan hyödyntää myös sellaisen erityistiedon saamiseksi, jota ei muuten olisi saatavilla. Esimerkiksi fluoresenssin talteenotossa fotobleaching (FRAP) – kokeiden jälkeen kohdealueen fluoriforeja vaalennetaan tarkoituksellisesti liiallisella säteilytasolla. Kun uudet fluoriforimolekyylit diffundoituvat näytteen valkaistulle alueelle (talteenotto), fluoresenssiemissioiden intensiteettiä seurataan kohdefluoriforian sivusuuntaisen diffuusionopeuden määrittämiseksi. Tällä tavoin fluoresenssilla merkittyjen molekyylien translationaalinen liikkuvuus voidaan todeta hyvin pienellä (2-5 mikrometrin) alueella yksittäisessä solussa tai elävän kudoksen osassa.

myötävaikuttavat tekijät

Brian Herman – Cellular and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Matthew J. Parry-Hill, Ian D. Johnson ja Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.