fenomenul de photobleaching (de asemenea, denumit în mod obișnuit ca decolorare) apare atunci când un fluorofor pierde permanent abilitatea de a fluoresce datorită deteriorării chimice induse de fotoni și modificării covalente. La trecerea de la o stare singlet excitată la starea tripletă excitată, fluoroforii pot interacționa cu o altă moleculă pentru a produce modificări covalente ireversibile. Starea tripletă are o durată relativ lungă de viață în raport cu starea singlet, permițând astfel moleculelor excitate un interval de timp mult mai lung să sufere reacții chimice cu componentele din mediu. Numărul mediu de cicluri de excitație și emisie care apar pentru un anumit fluorofor înainte de fotobleaching depinde de structura moleculară și de mediul local. Unii fluorofori se înălbesc rapid după ce emit doar câțiva fotoni, în timp ce alții care sunt mai robusti pot suferi mii sau milioane de cicluri înainte de albire. Acest tutorial interactiv explorează variațiile ratelor de albire a fotografiilor în specimene de fluorescență cu etichete unice, duale și multiplicate.

tutorialul inițializează cu o pereche de imagini fluorescente identice care apar în imaginea nealbită și în ferestrele de imagine Fotobleached. Pentru a opera tutorialul, faceți clic pe butonul declanșator pentru a deschide obturatorul virtual și pentru a permite imaginii Fotobleached să se estompeze sau photobleach la o rată mult exagerată pe o perioadă de timp fixă. Decolorarea poate fi oprită în orice moment făcând clic pe butonul Pauză (care devine un buton Start), apoi reluat făcând clic pe butonul Start. În exemplarele etichetate dual și triple, diferitele rate individuale de albire a fluoroforului pot fi vizualizate individual folosind casetele de selectare canale de culoare (setarea implicită este toate canalele activate). De exemplu, dacă faceți clic pe caseta de selectare roșie pentru un specimen cu etichetare triplă, va apărea doar canalul de culoare roșie. Fie două, fie toate cele trei canale de culoare pot fi amestecate împreună în exemplare etichetate Multiplicate folosind caseta de selectare Adăugare. Un nou specimen poate fi selectat folosind meniul derulant alegeți un Specimen. Numele specimenelor includ următoarele informații de etichetare a fluoroforului: FITC, izotiocianat de fluoresceină; triplu, un fluorofor roșu, verde și albastru; Dual, doi fluorofori; DAPI, 4′, 6-diamidino-2-fenilindol; MitoTracker, o sondă mitocondrială; Alexa 488, un fluorofor verde; și Auto, autofluorescență. Tutorialul este conceput pentru a modifica aleatoriu ratele de albire a fotografiilor pentru fluoroforii individuali la reîncărcare, astfel încât făcând clic pe butonul declanșator în mod repetat, va demonstra modul în care imaginea apare pe măsură ce rata de albire a fluorescenței se schimbă pentru fiecare dintre semnalele de culoare.

deoarece fotobleaching, un fenomen foarte slab înțeles, duce la o pierdere dramatică a intensității emisiei de fluorescență în majoritatea specimenelor, controlul artefactului este esențial pentru a capta cu succes imagini satisfăcătoare. Ca exemplu pentru un fluorocrom tipic, randamentul cuantic pentru fotobleaching de fluoresceină la intensitate de iluminare medie până la mare dictează că o moleculă medie va emite între 30 și 40 de mii de fotoni în timpul vieții sale utile (înainte de a deveni permanent dezactivat). În plus, numărul de cicluri de excitație și emisie este constant pentru un fluorofor dat, indiferent de modul în care este livrată energia de excitație, fie în impulsuri discrete, fie prin iluminare continuă. Prin urmare, reducerea nivelului luminii de excitație prin utilizarea filtrelor de densitate neutră nu împiedică fotobleaching-ul, ci doar reduce rata.

prezentat în Figura 1 este un exemplu tipic de fotobleaching (decolorare) observat într-o serie de imagini digitale capturate în diferite momente de timp pentru o secțiune subțire de criostat înmulțit (16 micrometri) a intestinului de șoarece. Nucleele au fost colorate cu verde Sytox (fluorescență verde), în timp ce mucusul celulelor calice și actina filamentoasă din marginea periei au fost colorate cu Alexa Fluor 350 aglutinină din germeni de grâu (fluorescență albastră) și, respectiv, Alexa Fluor 568 faloidină (fluorescență roșie). Punctele de timp au fost luate la intervale de două minute folosind o combinație de filtre de fluorescență cu lățimi de bandă reglate pentru a excita simultan cei trei fluorofori, înregistrând în același timp semnalele de emisie combinate. Rețineți că toți cei trei fluorofori au o intensitate relativ ridicată în Figura 1(A), dar intensitățile Alexa Fluor 350 și 568 (albastru și roșu) încep să scadă rapid la două minute și sunt aproape complet dispărute la șase minute. Nucleele colorate verde sunt mai rezistente la fotobleaching, dar intensitatea lor scade constant pe parcursul secvenței temporizate (10 minute). O mare varietate de reactivi antifade sintetici va reduce semnificativ rata de albire.

o clasă importantă de evenimente fotobleaching sunt fotodinamice, ceea ce înseamnă că implică interacțiunea fluoroforului cu o combinație de lumină și oxigen. Reacțiile dintre fluorofori și oxigenul molecular distrug permanent fluorescența și produc o specie de oxigen singlet de radicali liberi care poate modifica chimic alte molecule din celulele vii. Cantitatea de fotobleaching datorată evenimentelor fotodinamice este o funcție a concentrației moleculare de oxigen și a distanței proximale dintre fluorofor, moleculele de oxigen și alte componente celulare. Fotobleachingul poate fi redus prin limitarea timpului de expunere al fluoroforilor la iluminare sau prin scăderea energiei de excitație. Cu toate acestea, aceste tehnici reduc și semnalul de fluorescență măsurabil. În multe cazuri, soluțiile de fluorofori sau suspensii celulare pot fi dezoxigenate, dar acest lucru nu este fezabil pentru celulele și țesuturile vii. Poate că cea mai bună protecție împotriva fotobleaching-ului este limitarea expunerii fluorocromului la iluminare intensă (folosind filtre de densitate neutră) cuplată cu utilizarea judicioasă a reactivilor antifade disponibili în comerț care pot fi adăugați la soluția de montare sau la mediul de cultură celulară.

în anumite circumstanțe, efectul fotobleaching poate fi, de asemenea, utilizat pentru a obține informații specifice care altfel nu ar fi disponibile. De exemplu, în recuperarea fluorescenței după experimentele fotobleaching (FRAP), fluoroforii dintr-o regiune țintă sunt albiți intenționat cu niveluri excesive de iradiere. Pe măsură ce noile molecule de fluorofor difuzează în regiunea albită a specimenului (recuperare), intensitatea emisiei de fluorescență este monitorizată pentru a determina ratele de difuzie laterală ale fluoroforului țintă. În acest mod, mobilitatea translațională a moleculelor marcate fluorescent poate fi stabilită într-o regiune foarte mică (2 până la 5 micrometri) a unei singure celule sau secțiuni de țesut viu.Brian Herman-Departamentul de Biologie Celulară și structurală, Universitatea din Texas Health Science Center, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.Matthew J. Parry-Hill, Ian D. Johnson și Michael W. Davidson – Laboratorul Național de câmp Magnetic înalt, 1800 East Paul Dirac Dr., Universitatea de Stat din Florida, Tallahassee, Florida, 32310.