fenomenet fotoblekning (även vanligen kallad fading) uppstår när en fluorofor permanent förlorar förmåga att fluorescera på grund av Fotoninducerad kemisk skada och kovalent modifiering. Vid övergång från ett upphetsat singlet-tillstånd till det upphetsade tripletttillståndet kan fluoroforer interagera med en annan molekyl för att producera irreversibla kovalenta modifieringar. Tripletttillståndet är relativt långlivat med avseende på singlet-tillståndet, vilket möjliggör upphetsade molekyler en mycket längre tidsram för att genomgå kemiska reaktioner med komponenter i miljön. Det genomsnittliga antalet exciterings-och emissionscykler som uppstår för en viss fluorofor före fotoblekning är beroende av molekylstrukturen och den lokala miljön. Vissa fluoroforer bleker snabbt efter att ha emitterat bara några fotoner, medan andra som är mer robusta kan genomgå tusentals eller miljoner cykler före blekning. Denna interaktiva handledning utforskar variationer i fotoblekningshastigheter i enkla, dubbla och multiplicera märkta fluorescensprover.

handledningen initieras med ett par identiska fluorescensbilder som visas i de oblekta bild-och Fotoblekta bildfönstren. För att kunna använda handledningen klickar du på avtryckaren för att öppna den virtuella slutaren och låta den Fotoblekta bildbilden blekna eller fotobleka med en kraftigt överdriven hastighet under en fast tidsperiod. Fading kan stoppas när som helst genom att klicka på pausknappen (som blir en startknapp) och sedan återupptas genom att klicka på startknappen. I dubbel-och trippelmärkta exemplar kan de olika individuella fluorofor-blekningshastigheterna ses individuellt med kryssrutorna färgkanaler (Standardinställningen är alla kanaler aktiverade). Om du till exempel klickar på den röda kryssrutan för ett prov med trippelmärkning visas bara den röda färgkanalen. Antingen två eller alla tre av färgkanalerna kan blandas ihop i multiplicera märkta exemplar med kryssrutan Lägg till. Ett nytt prov kan väljas med hjälp av rullgardinsmenyn Välj ett prov. Provnamn inkluderar följande information om fluorofor: FITC, fluoresceinisotiocyanat; trippel, en röd, grön och blå fluorofor; dubbla, två fluoroforer; DAPI,4′, 6-diamidino-2-fenylindol; MitoTracker, en mitokondriell sond; Alexa 488, en grön fluorofor; och Auto, autofluorescens. Handledningen är utformad för att slumpmässigt ändra fotoblekningshastigheter för enskilda fluoroforer vid omlastning, så att klicka på avtryckaren upprepade gånger kommer att visa hur bilden visas när fluorescensförblekningshastigheten ändras för var och en av färgsignalerna.

eftersom fotoblekning, ett mycket dåligt förstått fenomen, leder till en dramatisk förlust av fluorescensutsläppsintensitet i de flesta exemplar, är det viktigt att kontrollera artefakten för att framgångsrikt fånga tillfredsställande bilder. Som ett exempel för en typisk fluorokrom dikterar kvantutbytet för fotoblekning av fluorescein vid medium till hög belysningsintensitet att en genomsnittlig molekyl kommer att avge mellan 30 och 40 tusen fotoner under dess användbara livstid (innan den blir permanent inaktiverad). Dessutom är antalet exciterings-och emissionscykler konstant för en given fluorofor oavsett hur exciteringsenergin levereras, antingen i diskreta pulser eller genom kontinuerlig belysning. Att minska exciteringsljusnivån genom att använda neutrala densitetsfilter förhindrar därför inte fotoblekning, det minskar bara hastigheten.

presenterad i Figur 1 är ett typiskt exempel på fotoblekning (blekning) observerad i en serie digitala bilder som fångats vid olika tidpunkter för en multiplicerad färgad kryostat tunn sektion (16 mikrometer) mustarm. Kärnorna färgades med Sytox Green (grön fluorescens), medan slemet av bägge celler och det filamentösa aktin i borstgränsen färgades med Alexa Fluor 350 vetegroddar agglutinin (blå fluorescens) respektive Alexa Fluor 568 phalloidin (röd fluorescens). Tidpunkter togs i två minuters intervall med användning av en fluorescensfilterkombination med bandbredder inställda för att excitera de tre fluoroforerna samtidigt samtidigt som de registrerar de kombinerade emissionssignalerna. Observera att alla tre fluoroforer har en relativt hög intensitet i Figur 1 (A), men Alexa Fluor 350 och 568 (blå och röd) intensiteter börjar sjunka snabbt på två minuter och är nästan helt borta på sex minuter. De grönfärgade kärnorna är mer resistenta mot fotoblekning, men deras intensitet sjunker också stadigt under den tidsbestämda sekvensen (10 minuter). Ett brett utbud av syntetiska antifade reagens kommer avsevärt att minska fotoblekningshastigheten.

en viktig klass av fotoblekningshändelser är fotodynamiska, vilket innebär att de involverar interaktionen mellan fluoroforen och en kombination av ljus och syre. Reaktioner mellan fluoroforer och molekylärt syre förstör permanent fluorescens och ger en fri radikal singlet syrearter som kemiskt kan modifiera andra molekyler i levande celler. Mängden fotoblekning på grund av fotodynamiska händelser är en funktion av den molekylära syrekoncentrationen och det proximala avståndet mellan fluorofor, syremolekyler och andra cellulära komponenter. Fotoblekning kan minskas genom att begränsa exponeringstiden för fluoroforer till belysning eller genom att sänka exciteringsenergin. Men dessa tekniker minskar också den mätbara fluorescenssignalen. I många fall kan lösningar av fluoroforer eller cellsuspensioner avoxideras, men detta är inte möjligt för levande celler och vävnader. Kanske är det bästa skyddet mot fotoblekning att begränsa exponeringen av fluorokromen till intensiv belysning (med hjälp av neutrala densitetsfilter) i kombination med den förnuftiga användningen av kommersiellt tillgängliga antifade-reagenser som kan läggas till monteringslösningen eller cellodlingsmediet.

under vissa omständigheter kan fotoblekningseffekten också användas för att erhålla specifik information som annars inte skulle vara tillgänglig. Till exempel i fluorescenceåtervinning efter photobleaching (FRAP) experiment, fluorophores inom en uppsätta som målregion bleks avsiktligt med överdrivna nivåer av bestrålning. När nya fluoroformolekyler diffunderar in i det blekta området i provet (återvinning) övervakas fluorescensutsläppsintensiteten för att bestämma sidodiffusionshastigheterna för målfluoroforen. På detta sätt kan den translationella rörligheten hos fluorescerande märkta molekyler fastställas inom en mycket liten (2 till 5 mikrometer) region i en enda cell eller sektion av levande vävnad.

bidragande författare

Brian Herman-Institutionen för cellulär och strukturell biologi, University of Texas Health Science Center, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Matthew J. Parry-Hill, Ian D. Johnson och Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.