fenomén foto – (také obyčejně odkazoval se na jako blednutí) nastane, když fluorophore trvale ztrácí schopnost fluoreskovat v důsledku fotonem-indukované chemické poškození a kovalentní modifikace. Při přechodu z excitovaného singletového stavu do excitovaného triplet státu, fluorophores se mohou vzájemně ovlivňovat s další molekulou vyrábět ireverzibilní kovalentní modifikace. Trojice státu je relativně dlouhým poločasem s ohledem na singletového stavu, což umožňuje excitaci molekul mnohem delší časový rámec k uskutečnění chemické reakce se složkami životního prostředí. Průměrný počet excitačních a emisních cyklů, které se vyskytují na konkrétním fluorophore před foto-je závislá na molekulární strukturu a místní prostředí. Některé fluorophores bělidlo rychle po vyzařují jen málo fotonů, zatímco jiní, že jsou robustnější, mohou podstoupit tisíce nebo miliony cyklů, než bělení. Tento interaktivní výukový program zkoumá rozdíly ve foto sazby v single, dual, a násobit označeny fluorescenční vzorky.

tutoriál inicializuje dvojicí identických fluorescenčních obrazů, které se objevují v Neběleném obrazu a Fotobleached obrazových oknech. Chcete-li ovládat tutoriál, kliknutím na tlačítko spouště otevřete virtuální závěrku a umožněte, aby obraz Fotobleached obraz vybledl nebo fotobleachoval značně přehnanou rychlostí po určitou dobu. Blednutí lze kdykoli zastavit kliknutím na tlačítko pauzy (které se stává tlačítkem Start) a poté pokračovat kliknutím na tlačítko Start. V dual a triple označeny vzorky, různá individuální fluorophore bělení sazby lze zobrazit jednotlivě pomocí Barevných Kanálů políček (výchozí nastavení je všechny kanály zapnuty). Například kliknutím na červené zaškrtávací políčko u vzorku s trojitým označením se zobrazí pouze kanál červené barvy. Buď dva nebo všechny tři barevné kanály mohou být smíchány dohromady v násobně označených vzorcích pomocí zaškrtávacího políčka Přidat. Nový vzorek lze vybrat pomocí rozbalovací nabídky vybrat vzorek. Exemplář jména patří následující fluorophore adresné informace: FITC fluorescein isothiokyanátem, Třílůžkové, červené, zelené a modré fluorophore; Dual, dvě fluorophores; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; MitoTracker, mitochondriální sondy; Alexa 488, zelené fluorophore; a Auto, autofluorescence. Výukový program je navržen tak, aby náhodně změnit foto sazby pro jednotlivé fluorophores na překládání, tak, že kliknutím na tlačítko Spouště opakovaně ukazují, jak obraz vypadá jako fluorescenční bělicí změny sazeb pro jednotlivé barevné signály.

Protože foto, velmi špatně rozuměl jev, vede k dramatickému úbytku fluorescence intenzita emisí ve většině vzorků, ovládání artefakt je rozhodující pro to, aby úspěšně zachytit uspokojivé snímky. Jako příklad pro typickou fluorochrome, kvantový výtěžek pro foto-fluoresceinu na střední až vysoká intenzita světla určuje, že průměrná molekula bude vydávat mezi 30 až 40 tisíc fotonů během jeho životnosti (než se stal trvale zdravotně postižené). Kromě toho, počet excitačních a emisních cyklů je konstantní pro danou fluorophore bez ohledu na to, jak excitační energie je dodávána buď v diskrétních pulsů nebo prostřednictvím nepřetržitého osvětlení. Proto snížení úrovně budicího světla pomocí filtrů s neutrální hustotou nebrání fotobleachingu, pouze snižuje rychlost.

uvedena na Obrázku 1 je typický příklad foto – (vyblednutí) pozorován v sérii digitálních snímků pořízených v různých časových bodech pro násobení-barevné kryostat výbrusu (16 mikrometrů) myší střeva. Jádra byly potřísněné Sytox green (Zelená fluorescence), zatímco hlen pohárkových buněk a vláknitý aktin v křoví hranice byly obarveny Alexa Fluor 350 wheat germ agglutinin (modrá fluorescence) a Alexa Fluor 568 phalloidin (červená fluorescence), resp. Časové body byly pořízeny ve dvou-minutových intervalech pomocí fluorescenční filtr kombinaci s šířkou pásma naladěni rozrušit tři fluorophores současně a zároveň nahrávat kombinované emise signály. Všimněte si, že všechny tři fluorophores mají relativně vysoké intenzity v Obrázku 1(a), ale Alexa Fluor 350 a 568 (modrá a červená), intenzitu začít klesat rychle na dvě minuty a jsou téměř úplně pryč na šest minut. Zelená jádra jsou odolnější vůči fotobleachingu,ale jejich intenzita také neustále klesá v průběhu časované sekvence (10 minut). Široká škála syntetických antifádových činidel významně sníží rychlost odbarvování.

důležitou třídu foto události jsou fotodynamická, což znamená, že zahrnují interakce fluorophore s kombinací světla a kyslíku. Reakce mezi fluorofory a molekulárním kyslíkem trvale ničí fluorescenci a poskytují volné radikály singletové druhy kyslíku, které mohou chemicky modifikovat jiné molekuly v živých buňkách. Množství foto-vzhledem k fotodynamické události je funkcí molekulové koncentrace kyslíku a proximální vzdálenost mezi fluorophore, molekuly kyslíku, a dalších buněčných složek. Fotobleaching lze snížit omezením doby expozice fluoroforů na osvětlení nebo snížením excitační energie. Tyto techniky však také snižují měřitelný fluorescenční signál. V mnoha případech mohou být roztoky fluoroforů nebo buněčných suspenzí deoxygenovány, ale to není možné pro živé buňky a tkáně. Možná nejlepší ochranu proti foto-je omezit expozici fluorochrome intenzivní osvětlení (pomocí neutrální hustotou filtry) spolu s rozumné využívání komerčně dostupných antifade činidel, které mohou být přidány do montážní řešení, nebo médium pro kultivaci buněk.

za určitých okolností lze fotobleachingový efekt využít také k získání konkrétních informací, které by jinak nebyly k dispozici. Například, fluorescence recovery po foto – (FRAP) experimenty, fluorophores v cílové oblasti jsou úmyslně bělené s nadměrnou úrovní ozáření. Jako nové molekuly fluoroforu difundují do bělené oblasti vzorku (zotavení), intenzita fluorescenční emise je sledována pro stanovení rychlosti laterální difúze cílového fluoroforu. Tímto způsobem lze translační pohyblivost fluorescenčně značených molekul zjistit ve velmi malé (2 až 5 mikrometrů) oblasti jedné buňky nebo části živé tkáně.

Přispívajících Autorů

Brian Herman – Oddělení Buněčné a Strukturní Biologie, University of Texas Health Science Center, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Matthew. J. Parry-Hill, Ian D. Johnson, a Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.