a jelenség a fotobleaching (is közkeletű nevén fading) akkor fordul elő, amikor egy fluorofor véglegesen elveszíti a fényfolt fluoreszkáló képesség a Foton által kiváltott kémiai károsodás és a kovalens módosítás miatt. A gerjesztett szingulett állapotból a gerjesztett hármasállapotba való átmenet után a fluoroforok kölcsönhatásba léphetnek egy másik molekulával, hogy irreverzibilis kovalens módosításokat hozzanak létre. A hármas állapot viszonylag hosszú élettartamú a szingulett állapothoz képest, így a gerjesztett molekulák sokkal hosszabb időn belül kémiai reakciókon mennek keresztül a környezetben lévő komponensekkel. Egy adott fluorofor fényfehérítés előtti gerjesztési és emissziós ciklusainak átlagos száma függ a molekulaszerkezettől és a helyi környezettől. Néhány fluorofor gyorsan fehérít, miután csak néhány fotont bocsátott ki, míg mások, amelyek robusztusabbak, több ezer vagy millió cikluson mennek keresztül a fehérítés előtt. Ez az interaktív bemutató a fényfehérítés arányának variációit tárja fel egyetlen, kettős és többszörösen jelölt fluoreszcens mintákban.

a bemutató inicializálja egy pár azonos fluoreszcens képek jelennek meg a fehérítetlen kép és Photobleached kép ablakok. Az oktatóanyag működtetéséhez kattintson az exponáló gombra a virtuális redőny megnyitásához, és hagyja, hogy a Fotófehérített kép elhalványuljon vagy fotófehéredjen egy erősen eltúlzott sebességgel egy meghatározott időtartam alatt. A Fading bármikor leállítható a Szünet gombra kattintva (amely Start gomb lesz), majd a Start gombra kattintva folytatható. Kettős és hármas címkével ellátott mintákban a különböző egyedi fluorofór fehérítési arányok külön-külön megtekinthetők a színes csatornák jelölőnégyzetekkel (az alapértelmezett beállítás az összes csatorna be van kapcsolva). Például, ha a hármas címkével ellátott minta piros jelölőnégyzetére kattint, csak a piros színű csatorna jelenik meg. A Hozzáadás jelölőnégyzet segítségével két vagy mindhárom színcsatorna összekeverhető többszörösen címkézett mintákban. Egy új minta kiválasztható a minta kiválasztása legördülő menü segítségével. A mintanevek a következő fluorofór címkézési információkat tartalmazzák: FITC, fluoreszcein izotiocianát; hármas, piros, zöld és kék fluorofor; kettős, két fluorofor; DAPI, 4′, 6-diamidino-2-fenilindol; MitoTracker, mitokondriális szonda; Alexa 488, zöld fluorofor; és Auto, autofluoreszcencia. Az oktatóanyag célja, hogy véletlenszerűen megváltoztassa az egyes fluoroforok fényfehérítési sebességét újratöltéskor, így az exponáló gombra való ismételt kattintás megmutatja, hogyan jelenik meg a kép, amikor a fluoreszcencia fehérítési sebessége megváltozik az egyes színjeleknél.

mivel a fotobleaching, egy nagyon rosszul megértett jelenség, a legtöbb mintában a fluoreszcencia emisszió intenzitásának drámai elvesztéséhez vezet, a műtárgy ellenőrzése kritikus fontosságú a kielégítő képek sikeres rögzítéséhez. Például egy tipikus fluorokrómra, a fluoreszcein fényfehérítésének kvantumhozama közepes vagy magas megvilágítási intenzitással azt diktálja, hogy egy átlagos molekula hasznos élettartama alatt 30-40 ezer fotont bocsát ki (mielőtt véglegesen fogyatékossá válna). Ezenkívül a gerjesztési és emissziós ciklusok száma állandó egy adott fluorofor esetében, függetlenül attól, hogy a gerjesztési energia hogyan kerül leadásra, akár diszkrét impulzusokban, akár folyamatos megvilágítással. Ezért a gerjesztési fényszint csökkentése semleges sűrűségű szűrők alkalmazásával nem akadályozza meg a fotobleachinget, csupán csökkenti a sebességet.

az 1. ábrán bemutatott tipikus példa a fotobleachingre (elhalványulásra), amelyet különböző időpontokban rögzített digitális képek sorozatában figyeltek meg az egér bélének többszörösen festett kriosztát vékony szakaszához (16 mikrométer). A magokat Sytox Green (Zöld fluoreszcencia), míg a serlegsejtek nyálkahártyáját és a kefe határán lévő fonalas aktint Alexa Fluor 350 búzacsíra agglutininnel (kék fluoreszcencia) és Alexa Fluor 568 falloidinnal (vörös fluoreszcencia) festették. Az időpontokat kétperces időközönként vettük fel fluoreszcens szűrő kombinációval, sávszélességekkel, amelyek a három fluorofor egyidejű gerjesztésére vannak beállítva, miközben rögzítik a kombinált emissziós jeleket is. Megjegyezzük, hogy mindhárom fluorofór viszonylag magas intenzitással rendelkezik az 1(a) ábrán, de az Alexa Fluor 350 és 568 (kék és piros) intenzitása két perc múlva gyorsan csökken, és majdnem teljesen eltűnik hat perc alatt. A zöld színű magok jobban ellenállnak a fotobleachingnek, de intenzitásuk is folyamatosan csökken az időzített szekvencia során (10 perc). A szintetikus antifade reagensek széles választéka jelentősen csökkenti a fényfehérítés sebességét.

a fotobleaching események egy fontos osztálya fotodinamikus, ami azt jelenti, hogy a fluorofor kölcsönhatásba lép a fény és az oxigén kombinációjával. A fluoroforok és a molekuláris oxigén közötti reakciók véglegesen elpusztítják a fluoreszcenciát, és szabad gyökös szingulett oxigénfajokat hoznak létre, amelyek kémiailag módosíthatják az élő sejtek más molekuláit. A fotodinamikai események miatti fotobleaching mennyisége a molekuláris oxigénkoncentráció és a fluorofor, az oxigénmolekulák és más sejtkomponensek közötti proximális távolság függvénye. A fényfehérítés csökkenthető a fluoroforok expozíciós idejének megvilágításra korlátozásával vagy a gerjesztési energia csökkentésével. Ezek a technikák azonban csökkentik a mérhető fluoreszcencia jelet is. Sok esetben a fluoroforok vagy sejtszuszpenziók oldatai oxigénmentesíthetők, de ez az élő sejtek és szövetek esetében nem megvalósítható. A fényfehérítés ellen talán a legjobb védelem a fluorokróm intenzív megvilágításnak való kitettségének korlátozása (semleges sűrűségű szűrők alkalmazásával), a kereskedelemben kapható antifade reagensek ésszerű használatával párosulva, amelyek hozzáadhatók a szerelési oldathoz vagy a sejttenyésztő táptalajhoz.

bizonyos körülmények között a fényfehérítő hatás felhasználható olyan konkrét információk megszerzésére is, amelyek egyébként nem lennének elérhetők. Például a fluoreszcencia visszanyerése után fotobleaching (FRAP) kísérletek, a célrégión belüli fluorofórokat szándékosan fehérítik túlzott mértékű besugárzással. Amint az új fluorofor molekulák diffundálnak a minta fehérített régiójába (visszanyerés), a fluoreszcencia emisszió intenzitását monitorozzuk a cél fluorofor laterális diffúziós sebességének meghatározásához. Ily módon a fluoreszcensen jelölt molekulák transzlációs mobilitása megállapítható egyetlen sejt vagy élő szövet egy nagyon kicsi (2-5 mikrométer) régiójában.

közreműködő szerzők

Brian Herman-Department of Cellular and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.Matthew J. Parry-Hill, Ian D. Johnson és Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida Állami Egyetem, Tallahassee, Florida, 32310.