zjawisko fotobleachingu (powszechnie określane jako blaknięcie) występuje, gdy fluorofor trwale traci zdolność fluorescencji z powodu uszkodzeń chemicznych wywołanych fotonami i modyfikacji kowalencyjnej. Po przejściu od wzbudzonego stanu singletowego do wzbudzonego stanu trypletowego fluorofory mogą wchodzić w interakcje z inną cząsteczką w celu wytworzenia nieodwracalnych modyfikacji kowalencyjnych. Stan trypletowy jest stosunkowo długowieczny w stosunku do stanu singletowego, co pozwala wzbudzonym cząsteczkom znacznie dłużej przechodzić reakcje chemiczne ze składnikami w środowisku. Średnia liczba cykli wzbudzenia i emisji, które występują dla konkretnego fluoroforu przed fotoblakowaniem, zależy od struktury molekularnej i lokalnego środowiska. Niektóre fluorofory wybielają się szybko po emisji tylko kilku fotonów, podczas gdy inne, które są bardziej wytrzymałe, mogą przejść tysiące lub miliony cykli przed wybieleniem. Ten interaktywny samouczek bada różnice w szybkości fotoobiegu w pojedynczych, podwójnych i wielokrotnych oznakowanych próbkach fluorescencji.

samouczek inicjalizuje się parą identycznych obrazów fluorescencyjnych pojawiających się w oknach niebielony obraz i zdjęcie. Aby uruchomić samouczek, kliknij przycisk migawki, aby otworzyć wirtualną migawkę i pozwolić na blaknięcie lub fotoblaknięcie obrazu w znacznie przesadzonym tempie w ustalonym okresie czasu. Blaknięcie można zatrzymać w dowolnym momencie, klikając przycisk Pause (który staje się przyciskiem Start), a następnie wznowić, klikając przycisk Start. W dual i triple oznaczone próbki, różne indywidualne fluorophore bielenia stawki mogą być oglądane indywidualnie za pomocą kanałów kolorów pola wyboru (domyślne ustawienie jest wszystkie kanały włączone). Na przykład kliknięcie czerwonego pola wyboru próbki z potrójnym oznakowaniem spowoduje wyświetlenie tylko kanału koloru czerwonego. Dwa lub wszystkie trzy kanały kolorów można mieszać razem w próbkach oznaczonych wielokrotnością za pomocą pola wyboru Dodaj. Nowy okaz można wybrać za pomocą rozwijanego menu wybierz okaz. Nazwy próbek obejmują następujące informacje o etykietowaniu fluoroforów: FITC, izotiocyjanian fluoresceiny; potrójny, czerwony, zielony i niebieski fluorofor; Podwójny, Dwa fluorofory; DAPI, 4′, 6-diamidino-2-fenylindol; MitoTracker, sonda mitochondrialna; Alexa 488, zielony fluorofor; i Auto, autofluorescencja. Samouczek ma na celu losową zmianę szybkości świecenia dla poszczególnych fluoroforów po ponownym załadowaniu, dzięki czemu wielokrotne kliknięcie przycisku migawki pokaże, w jaki sposób obraz pojawia się, gdy zmienia się szybkość wybielania fluorescencji dla każdego z sygnałów kolorów.

ponieważ photobleaching, bardzo słabo poznane zjawisko, prowadzi do dramatycznej utraty intensywności emisji fluorescencji w większości próbek, kontrolowanie artefaktu jest kluczowe, aby skutecznie uchwycić zadowalające obrazy. Jako przykład dla typowego fluorochromu, wydajność kwantowa dla fotobleachingu fluoresceiny przy średnim do wysokiego natężeniu oświetlenia dyktuje, że średnia cząsteczka będzie emitować od 30 do 40 tysięcy fotonów podczas swojego użytecznego życia (zanim zostanie trwale wyłączona). Ponadto liczba cykli wzbudzenia i emisji jest stała dla danego fluoroforu, niezależnie od tego, w jaki sposób energia wzbudzenia jest dostarczana, w dyskretnych impulsach lub poprzez ciągłe oświetlenie. Dlatego zmniejszenie poziomu światła wzbudzenia za pomocą filtrów o neutralnej gęstości nie zapobiega fotoblakowaniu, a jedynie zmniejsza szybkość.

przedstawiony na fig.1 jest typowym przykładem fotoblakowania (blaknięcia) obserwowanego w serii obrazów cyfrowych rejestrowanych w różnych punktach czasowych dla zwielokrotnionego cienkiego odcinka kriostatu (16 mikrometrów) jelita myszy. Jądra zostały zabarwione Sytox Green (Zielona fluorescencja), podczas gdy śluz komórek kielicha i nitkowata aktyna w obramowaniu pędzla zostały zabarwione odpowiednio aglutyniną z kiełków pszenicy Alexa Fluor 350 (niebieska fluorescencja) i falloidiną Alexa Fluor 568 (czerwona fluorescencja). Punkty czasowe zostały podjęte w odstępach dwuminutowych przy użyciu kombinacji filtra fluorescencyjnego z pasmami dostrojonymi do wzbudzenia trzech fluoroforów jednocześnie, jednocześnie rejestrując połączone sygnały emisyjne. Zauważ, że wszystkie trzy fluorofory mają stosunkowo wysoką intensywność na fig. 1(A), ale Alexa Fluor 350 i 568 (niebieski i czerwony) intensywności zaczynają gwałtownie spadać po dwóch minutach i prawie całkowicie znikają po sześciu minutach. Zabarwione na Zielono jądra są bardziej odporne na photobleaching, ale ich intensywność również spada w miarę upływu czasu (10 minut). Szeroka gama syntetycznych odczynników przeciwfadowych znacznie zmniejszy szybkość fotoczyszczania.

ważna Klasa zdarzeń fotobleczniczych jest fotodynamiczna, co oznacza, że wiążą się z interakcją fluoroforu z kombinacją światła i tlenu. Reakcje między fluoroforami i cząsteczkowym tlenem trwale niszczą fluorescencję i dają wolny rodnik singletowy tlen, który może chemicznie modyfikować inne cząsteczki w żywych komórkach. Ilość fotobleachingu spowodowana zdarzeniami fotodynamicznymi jest funkcją molekularnego stężenia tlenu i bliższej odległości między fluoroforem, cząsteczkami tlenu i innymi składnikami komórkowymi. Photobleaching może być zmniejszona przez ograniczenie czasu ekspozycji fluorophores do oświetlenia lub przez obniżenie energii wzbudzenia. Jednak techniki te zmniejszają również mierzalny sygnał fluorescencji. W wielu przypadkach roztwory fluoroforów lub zawiesin komórkowych mogą być odtlenione, ale nie jest to możliwe dla żywych komórek i tkanek. Być może najlepszą ochroną przed fotoblakowaniem jest ograniczenie ekspozycji fluorochromu na intensywne oświetlenie (przy użyciu filtrów o neutralnej gęstości) w połączeniu z rozsądnym użyciem dostępnych w handlu odczynników przeciwfadowych, które można dodać do roztworu montażowego lub pożywki do hodowli komórkowej.

w pewnych okolicznościach efekt photobleaching może być również wykorzystany do uzyskania określonych informacji, które w przeciwnym razie nie byłyby dostępne. Na przykład, w fluorescence odzysku po photobleaching (FRAP) eksperymenty, fluorophores w obszarze docelowym celowo bielone z nadmiernym poziomem napromieniowania. Ponieważ nowe cząsteczki fluoroforu dyfundują do bielonego obszaru próbki (odzysk), intensywność emisji fluorescencji jest monitorowana w celu określenia bocznych szybkości dyfuzji docelowego fluoroforu. W ten sposób, translacyjna mobilność fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek może być ustalona w bardzo małym (2 do 5 mikrometrów) regionie pojedynczej komórki lub sekcji żywej tkanki.

autorzy współpracujący

Brian Herman – Department of Cellular and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Matthew J. Parry-Hill, Ian D. Johnson, and Michael W. Davidson-National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., the Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.